Culture cellulaire : quelles cellules et comment les manipuler

1. Considérations préalables

On sous entend par culture cellulaire la mise en oeuvre de cultures de cellules issues d'organismes multicellulaires.

Réaliser une culture cellulaire, c'est pratiquer un ensemble de techniques biologiques pour multiplier ces cellules le plus souvent hors de leur organisme d'origine (in vitro) et les utiliser comme support pour ces expérimentations.

Il faut donc avoir un projet nécessitant ce support très particulier et très contraignant : étude de molécules ou d'agents cytotoxiques, amplification de virus...

Pourquoi ces cellules représentent-elles un danger ?

• Elles peuvent abriter des agents biologiques au sein de leur entité.
• Elles peuvent servir de support à la culture de virus et ainsi véhiculer ceux-ci.
• La culture de cellules animales est très exigeante et en particulier sont utilisés des réactifs provenant d'organismes vivants qui peuvent contenir des agents biologiques comme par exemple le sérum de veau foetal.

2. Types de cellules

2.1 Origine des cellules

Elles sont prélevées à partir de sang, de tissus ou organes humains, animaux ou végétaux.

2.2 Différentes cultures

Sont distinguées :

• les cultures primaires, issues de la dissociation de tissus, d'une durée de vie restreinte (10 passages) par exemple des cardiomyocytes et fibroblastes de cœur d’embryon de poulet ;
• les cultures de cellules diploïdes : extraits de tissus embryonnaires (plus de 100 passages) comme les cellules MRC5 ;
• les cultures de lignées cellulaires continues (théoriquement passages infinis) provenant de
  • variants « immortels »  spontanés de cellules tumorales comme les cellules KB, Hela ;
  • cellules « immortalisées » expérimentalement à l’aide de virus ou d’un produit chimique comme les cellules Vero.

3. Technique employée pour le passage

Le passage est le nom donné à l'ensemble des manipulations qui permettent de passer d'une culture arrivée à saturation (nutriments et surface épuisés) à une culture jeune qui pourra évoluer durant 2 à 3 jours.
Ces gestes très nombreux et spécialisés sont réalisés en grande partie sous PSM pour garantir la non contamination du produit mais aussi pour garantir au manipulateur une sécurité microbiologique.

3.1. Préparation de la culture mère

Après vérification de la viabilité et de la non contamination de la culture mère au microscope inversé, il convient de décoller les cellules du support par l'ajout de trypsine après élimination du milieu usagé et rinçage de la couche cellulaire (enlèvement des cellules non fixées et des neutralisants de la trypsine dont l'alpha1 antitrypsine présent dans le sérum de veau foetal, additif indispensable à la croissance des cellules).

L'ajout de la trypsine, enzyme protéolytique, permet de catalyser les réactions d'hydrolyse des liaisons matrice - cellule et cellule - cellule. Cette action est favorisée par la chaleur (37 °C) et l'agitation. Cette action est suivie régulièrement au microscope inversé jusqu'à ce que les cellules apparaissent isolées et détachées de la plaque.

Il convient d'arrêter l'action de la trypsine par l'ajout d'un volume de milieu de culture (contenant du sérum de veau foetal).

3.2. Dénombrement

Les cellules sont dénombrées en hématimètre afin d'estimer leur pourcentage de viabilité (ajout d'un colorant différenciant les cellules mortes et celles viables) et leur concentration.

3.3. Ensemencement d’un milieu neuf

Un volume de suspension cellulaire est ajouté à du milieu complémenté afin d'obtenir une concentration adaptée permettant la croissance des cellules sur le support durant 2 à 3 jours sans chevauchement.

Le flask est ensuite mis à incuber dans une étuve thermostatée contenant une atmosphère enrichie en CO₂.

5. Ressources et références

• Utilisation d'un poste de sécurité microbiologique : procédure opérationnelle 3RB,
• ED 6131 : les risques biologiques liés aux techniques de génie génétique en laboratoire
• Diaporama sur les cultures cellulaires